Construção de vetor recombinante para avaliação da expressão do gene pdC de Gluconacetobacter diazotrophicus

Resumo

Trabalhos anteriores envolvendo a obtenção e seleção de mutantes defectivas para a produção de auxina em Gluconacetobacter diazotrophicus indicam que a principal rota de biossíntese deste fitohormônio nesta bactéria diazotrófica é a via do Indol-3-Ácido Pirúvico (IPyA). A enzima responsável pela segunda etapa desta rota em que ocorre a descarboxilação do IPyA gerando o Indol-3-Acetaldeído (IAAld) é a indol-3-piruvato descarboxilase. O gene que codifica esta enzima, o ipdC, não foi identificado no genoma de G. diazotrophicus; no entanto, foi identificada uma ORF (GDI_0172) com alta identidade (70%) ao gene que codifica a piruvato descarboxilase de Zimobacter palmae. Diante disso, o presente trabalho teve por objetivo gerar uma fusão transcricional entre a sequência promotora do gene pdC de G. diazotrophicus e o gene repórter gfp para acompanhar a atividade transcricional do gene pdC na estirpe PAL5 de G. diazotrophicus. A fusão transcricional foi obtida pela amplificação por PCR da sequência promotora de pdC empregando e, posterior clonagem no vetor pGEM®-T Easy. Após confirmação desta clonagem por análise de restrição com as enzimas EcoRI, SphI e BglII e sequenciamento, o fragmento correspondente ao promotor pdC foi subclonado ao vetor pHRGFPTC obtendo-se a construção ppdCGFP. No momento esta construção está sendo mobilizada para a estirpe PAL5 para a obtenção da estirpe a ser utilizada nos ensaios de expressão gênica.

Pretende-se empregar essa construção para analisar da expressão do gene repórter gfp sob controle do promotor do gene pdC de G. diazotrophicus em condições de cultivo que favoreçam a produção de auxina, bem como, durante o processo de interação planta-bactéria e seu futuro estudo da expressão gênico deste gene em condições de cultivo que favoreçam a produção de auxina, bem como, durante o processo de interação planta-bactéria.