Clonagem e expressão da proteína Fur recombinante de Gluconacetobacter diazotrophicus em sistema heterólogo

Resumo

Em bactérias gram-negativas, a proteína Fur (Ferric Uptake Regulator), um fator de transcrição, desempenha um papel central na regulação de genes responsivos à concentração de ferro, garantindo a correta expressão de genes relacionados a captação e metabolismo do ferro. O sequenciamento do genoma da bactéria diazotrófica endofítica Gluconacetobacter diazotrophicus possibilitou a identificação de uma proteína do tipo Fur codificada por GDI_1398 e, gerando a necessidade de estudos sobre regulação transcricional promovida por Fur, mais especificamente a interação entre esta proteína e o DNA de G. diazotrophicus. O ensaio de retardo da mobilidade na eletroforese (EMSA) é uma das formas mais rápidas de se analisar a interação entre DNA e proteína(s) in vitro; no entanto, para que seja realizado é preciso que se tenha a proteína alvo do estudo, neste caso, Fur, purificada. Diante dessa premissa, este trabalho teve por objetivo a clonagem da sequência codificante da proteína Fur de G. diazotrophicus e expressão desta proteína recombinante em Escherichia coli. Para a realização deste trabalho optou-se pelo emprego do sistema de expressão Gateway. Inicialmente, a sequência correspondente foi amplificada por PCR e clonada no vetor de expressão pDEST17 a partir de dois eventos de recombinação dando origem a construção pDEST17Fur. Esta construção foi mobilizada para a estirpe BL21-AI de E,coli a ser utilizada na expressão heteróloga da proteína Fur recombinante. Ensaios pilotos foram realizados a fim de se avaliar as condições ideais para expressão da proteína Fur recombinante, onde foram avaliados os seguintes fatores: tempo e temperatura de indução (30 e 37°C), onde pode-se observar a expressão da proteína nas duas temperaturas testadas e, que a partir de 30 minutos de indução observa-se expressão da proteína recombinante. No momento, deu-se início ao processo de purificação da proteína recombinante, que posteriormente será empregada nos experimentos de EMSA.